1.2.6總游離巰基和表面游離巰基測定

蛋清液和不同干燥方式蛋清粉之間蛋白質中總游離巰基和表面游離巰基的區(qū)別，摩爾消光系數(shù)為13600 M?1cm?1。

1.2.7傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析

用瑪瑙研缽將蛋清粉樣品磨細，將樣品與溴化鉀混合，壓成片狀后測量。25℃下，在4000~500 cm?1的波數(shù)范圍內對每個樣品進行分析。每個樣品以空氣為背景、KBr為空白對照進行掃描。每次測量都是32次掃描的疊加。用Omnic軟件基線校正和傅里葉自取卷積后使用PeakFit軟件對1600~1700 cm?1區(qū)域進行歸一化。利用高斯峰和曲線擬合模型對二級結構組分進行定量估計。

1.2.8溶解度測定

稱取0.2 g蛋清粉溶解于20 mL DDW，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將溶液的pH調節(jié)至2.0，4.0，6.0，8.0和10.0，混合溶液在30℃下以100 r/min的轉速攪拌30 min，然后7500×g，離心10 min，取上清，用Lowry法測定上清液蛋白質含量。全蛋白含量用蛋白溶解液（20 mmol/L PBS，2%SDS，8 mol/L Urea，pH8.0）充分溶解蛋白樣品后的蛋白含量表示。

溶解度(%) =上清液蛋白質含量/總蛋白質含量 ×100%

1.2.9接觸角測定

接觸角是三相（液、固、氣）接觸點的切角，是測定粉體潤濕性的常用參數(shù)。由于潤濕行為是一個動態(tài)過程，因此可以通過監(jiān)測接觸角的變化率來量化潤濕過程。用接觸角測量儀測量粉體的水接觸角變化。設置的參數(shù)為5μL水滴體積和介質滴定速率。記錄0~60 s的接觸角。每個樣品的測量至少重復5次。

1.2.10表面張力測定

采用全自動表面張力儀，以及最大壓力法測定不同pH下濃度為1%（w/v）的蛋清溶液表面張力。

1.2.11乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

蛋清蛋白的乳化活性指數(shù)（emulsifying ability index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）測定。制備不同pH（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0）含1%（w/v）蛋清蛋白的溶液，取15 mL溶液與5 mL玉米油混合，在10000 r/min條件下高速均質1 min。分別在0、30 min時從離心管底部取50μL溶液，加入到4950μL 0.1%SDS溶液中，渦旋5 s混勻，立即在500 nm波長處測定吸光度。

為時間差/min；At為放置30 min后吸光度。

1.2.12起泡性和泡沫穩(wěn)定性

測定蛋清蛋白的起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S），將蛋清蛋白溶液稀釋至1%（w/v），調節(jié)pH至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，用高速分散器以10000 r/min的速度均質1 min，記錄均質前后體積。將樣品靜置30 min后，再次記錄樣品體積。

式中：V1為均質前體積（mL）；V2為均質后體積（mL）；V3為均質30 min后體積（mL）。

1.2.13乳液的微觀結構分析

1.2.13.1乳液的制備

蛋清蛋白乳液的制備:90 mL含1%（w/v）蛋清蛋白溶液的超純水作為乳液的水相，10 mL玉米油為油相，10000 r/min條件下高速均質2 min，分別50 MPa高壓均質0、1、2次（分別用EWP-P0、EWP-P1、EWP-P2和EWP-D0、EWP-D1、EWP-D2表示）。加入0.02%NaN3作為防腐劑，抑制細菌增長。

1.2.13.2熒光倒置顯微鏡

用熒光倒置顯微鏡觀察蛋清液及不同干燥方式蛋清粉均質不同次數(shù)后乳液的微觀結構。取20μL乳液置于載玻片上，并用蓋玻片小心的蓋住。平衡2 min后，拍攝放大率為400倍下的蛋清蛋白乳液的微觀結構照片。

1.2.13.3激光掃描共聚焦顯微鏡

參考Xu等的方法并作適當修改。將樣品用0.1%（w/v）的尼羅紅和FITC試劑染色，并在黑暗中孵育10 min。在室溫下避光環(huán)境中由Leica TCS SP8系統(tǒng)在激發(fā)波長為488 nm下（放大倍數(shù)為400倍）進行分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有的試驗均至少重復三次取平均值加減標準差，利用IBM SPSS Statistics 21軟件和Duncan多重檢驗方法對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性分析，并采用Origin 9.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)及畫圖。

2.結果與分析

2.1不同干燥方式蛋清蛋白的SDS-PAGE分析

如圖1所示，蛋清中主要含有三種蛋白：卵清蛋白（45 kDa）、卵轉鐵蛋白（76 kDa）和卵粘蛋白。卵粘蛋白主要有α-和β-兩個亞基，α-卵粘蛋白又分為兩種類型：α1-和α2-，分子量分別為150和220 kDa；β-卵粘蛋白的分子量為400~720 kDa。非還原條件下SDS-PAGE上方出現(xiàn)許多高聚物條帶，添加β-巰基乙醇后，高聚物條帶消失，表明該高聚物由蛋白通過二硫鍵聚合而成。蛋清蛋白中原有的卵類粘蛋白與溶菌酶在本實驗室并未被檢測到，可能是由于卵類粘蛋白在蛋清前處理將稀釋、調節(jié)pH和攪拌時會發(fā)生絮凝，形成白色絮狀物，從而被離心除去。溶菌酶的不可逆變性臨界點是77℃，因此噴霧干燥（溫度高達180℃）過程中溶菌酶可能會變性從而造成損失。此外，冷凍干燥也會造成溶菌酶的損失，如Kudre等在比較日本鵪鶉（Coturnix japonica）和白來航雞（White Leghorn）冷凍干燥蛋清粉的SDS-PAGE時也發(fā)現(xiàn)了冷凍干燥過程中溶菌酶損失的現(xiàn)象。蛋清蛋白各組分在還原條件（圖1A）下的分子量略大于非還原條件（圖1B），這是因為SDS與蛋白質結合會引起蛋白質構象改變，使蛋白質形成一種長橢圓棒狀結構，加入足夠量的SDS和β-巰基乙醇可使蛋白質的遷移速率僅與蛋白質分子大小有關。未加入β-巰基乙醇（非還原狀態(tài)）時蛋白質遷移速度更快可能是因為蛋白質中的二硫鍵未打開，蛋白質與SDS結合形成長橢圓棒狀物的長軸較短，遷移速度更快，因此蛋白質條帶的分子量較小。EWP-C、EWP-P和EWP-D蛋白條帶幾乎沒有區(qū)別，表明本實驗的干燥條件未對蛋清蛋白組分造成明顯影響。

圖1蛋清液和不同干燥方式蛋清粉蛋白質模式圖

注：M.標準蛋白Marker；OVA.卵清蛋白；OVT.卵轉鐵蛋白；1.EWP-C；2.EWP-P；3.EWP-D。