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生物表面活性劑產生菌的篩選及對PAHs污染環(huán)境的修復效果研究（一）
來源：《農業(yè)環(huán)境科學學報》 瀏覽 473 次 發(fā)布時間:2025-07-30
篩選獲得一株生物表面活性劑產生菌，經生理生化與16S rDNA鑒定，獲得菌株為銅綠假單胞菌147（Pseudomonas aeruginosa 147）。發(fā)酵產物經過薄層色譜、紅外掃描分析其發(fā)酵產物為糖脂類生物表面活性劑（Biosurfactant，BS），單因素最佳發(fā)酵條件優(yōu)化為碳源、氮源和碳氮比分別為花生油、硫酸銨和25∶1，最佳培養(yǎng)溫度為30℃，pH值為8，NaCl濃度為5 g·L-1。在最佳條件下培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液的表面張力值比原來降低了42.08 mN·m-1，且能平穩(wěn)保持至144 h。在108 h細菌生物量最大，為2.63 g·L-1，此時產生的糖脂最多，可達2.02 g·L-1。生物表面活性劑對不同環(huán)數的多環(huán)芳烴類物質（熒蒽、芘、苯［a］芘）的增溶效果實驗表明：隨生物表面活性劑添加量的增大，不同PAHs溶解度均增大；相同濃度生物表面活性劑添加條件下，高環(huán)多環(huán)芳烴（苯［a］芘）的增溶效果低于低環(huán)多環(huán)芳烴（熒蒽、芘）。
多環(huán)芳烴（Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs）是一類由2個或2個以上苯環(huán)組成的稠環(huán)化合物。其水溶性低，易吸附于固體顆粒，能夠長期存在于環(huán)境中，是一類持久性有機污染物，也是美國國家環(huán)境保護局（U.S.Environmental Protection Agency）確定的優(yōu)先控制的污染物。由于PAHs高脂溶性，低生物可利用性，使得人們將其用于環(huán)境中的修復措施和效果存在局限。因此通過利用表面活性劑的膠團化作用，顯著提高疏水性有機化合物在水相中的表觀溶解度，從而提高其生物有效性，促進修復效果的表面活性劑強化修復技術（Surfactant enhanced remediation，SER）引起人們的關注。
目前在有機污染修復過程中使用的多為化學表面活性劑。由于化學表面活性劑不易降解、易造成二次污染、對土壤微生物產生毒害風險，限制了其在環(huán)境修復中的應用。生物表面活性劑以其具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液等的作用，其主要成分糖脂、磷脂、脂蛋白或脂肽類化合物、高分子化合物和脂多糖，能夠被生物完全降解，安全無毒，且用量少，發(fā)酵成本低，逐漸成為研究熱點。已有文獻報道通過篩選產表面活性劑的細菌，并將其應用于多環(huán)芳烴污染的修復。
生物表面活性劑合成方式包括動植物細胞內提取法、酶合成法、微生物發(fā)酵法。然而，動植物細胞內提取法受到原料來源的制約，難以大規(guī)模生產，酶合成法所用酶制劑的價格亦極大限制了其發(fā)展。相比而言，微生物發(fā)酵以其生產工藝簡單、經濟安全的特點，成為重要的生物表面活性劑來源。目前，已有很多微生物被發(fā)現(xiàn)能夠產生生物表面活性劑，如細菌類球擬酵母（Torulopsis bombicola）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerug-inosa），其中銅綠假單胞菌已有Pseudomonas cepacia CCT6659、Pseudomonas aeruginosa S6等見諸報道。它們產生的生物表面活性劑是目前在多環(huán)芳烴污染土壤修復，石油污染修復等應用較多，生物表面活性劑在增溶多環(huán)芳烴時具有生物降解性、低毒性、適應極端環(huán)境的優(yōu)勢。
本研究以PAHs為目標污染物，篩選產生物表面活性劑的菌株，并分析發(fā)酵產物為生物表面活性劑，優(yōu)化發(fā)酵條件，探討菌株產生的生物表面活性劑對典型多環(huán)芳烴熒蒽、芘、苯［a］芘的增溶作用，研究結果將為PAHs污染環(huán)境的修復技術研究提供菌株資源和基礎理論支撐。
1材料與方法
1.1供試土壤
采集南京煉油廠附近土樣、北京某加油站附近土樣、南京某河底淤泥和南京某湖底淤泥為土壤樣品。
1.2供試培養(yǎng)基與試劑
富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO410.00 g，KCl 1.10 g，KH2PO43.40 g，K2HPO44.40 g，MgSO40.50 g，EDTA 1.00 g，酵母粉0.50 g，液體石蠟5.00 mL，pH 7.0～7.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，用蒸餾水定容到1.00 L。
LB液體培養(yǎng)基：10.00 g蛋白胨，5.00 g酵母粉，10.00 g氯化鈉，用無菌水定容至1.00 L。
LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基加入15.00～20.00 g瓊脂粉。
無機鹽培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.00 g，NaCl 10.00 g，KH2PO40.20 g，K2HPO40.80 g，MgCl20.50 g，CaCl20.05 g，F(xiàn)eCl20.01 g。
血平板培養(yǎng)基：購自南京便診生物科技有限公司。
實驗試劑：甲醇為色譜純，花生油為食用級，其他試劑均為分析純。
1.3細菌篩選和鑒定
1.3.1表面活性劑產生菌血平板初篩
取5.00 g新鮮土樣置于裝有45 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)液混濁后，吸取5 mL培養(yǎng)液重新轉接入新的富集培養(yǎng)基中，按上述條件培養(yǎng)，轉接3次。后經濃度梯度稀釋，100μL涂布于血平板，30℃培養(yǎng)48h，選擇透明圈較大的菌落，分離純化，4℃保存。
1.3.2表面張力儀復篩
將上述純化的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，200 r·min-1、30℃培養(yǎng)96 h后，用表面張力儀測定細菌發(fā)酵液的表面張力。
1.3.3細菌鑒定
基于細菌形態(tài)與生理生化結果，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》做出初步鑒定。同時將菌株用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數生長期，離心法收集菌體，并采用SDS-CTAB法提取總基因組DNA，以細菌通用引物27F和1492R進行16S rDNA的PCR擴增，運用分子學鑒定菌株。